血浆治疗或诱发严重炎症风暴和急性肺损伤
XuHuandi，茄番，沐颜寒泱，小风，十三，姚西西，了木，CipherC
近期，血浆治疗作为一项治疗新冠肺炎的疗法被媒体报道，并引发了一定的讨论。但该疗法的获益与风险仍然未知。目前该治疗已被列入国家诊疗方案第6版。我们将基于香港大学、医院与广州医院等多单位协作于年发表的一篇关于SARS的基础研究，结合近期多项临床研究结果，讨论血浆治疗乃至相关的免疫治疗所带来的风险。
该文章被发表于JCIinsight（IF=6.），通讯作者为香港大学袁国勇院士，题目为Anti–spikeIgGcausessevereacutelunginjurybyskewingmacrophageresponsesduringacuteSARS-CoVinfection（抗S蛋白IgG通过改变巨噬细胞反应在急性SARS感染中诱发急性肺损伤），该文献于年7月发表。该研究提示：在病*未清除时高滴度中和抗体的存在会诱发严重炎症反应和急性肺损伤。
抗体或血浆治疗的理论基础为通过血浆中的中和抗体中和患者体内的病*，但是其作用存在疑问。
大部分病*性重症肺炎，包括SARS、COVID-19、流感肺炎等，其重症患者的基本病理生理学改变均为进展为ARDS并最终导致呼吸衰竭和死亡。一般认为ARDS是肺泡损害导致的后果，损伤因素导致促炎细胞因子的释放，引发肺泡上皮和毛细血管内皮损害，从而引起弥漫性肺泡损害(DAD)，表现为肺透明膜形成、肺泡内水肿、肺泡间隔增宽等一系列病理学表现。此前对COVID-19死亡患者的病理学检查也印证了COVID-19存在类似改变（点击查看相关文献）。
有相关文献报道了对SARS的研究中，抗S蛋白中和抗体（NAb）的应答速度在死亡患者体内比康复患者的应答速度更快。最终恢复的患者体内的NAb活性平均需要花20天的时间达到峰值，而死亡患者平均只需要14.7天。此外，死亡病人的NAb效价也比康复病人的效价显著高很多。而结合临床表现，SARS患者多在起病第12天进展为ARDS，此时发生了抗S蛋白IgG的血清学转换。与之相似，年甲流流行期间，在血浆中存在的抗流感抗体也被发现与严重临床表现和不良预后有关。因此，该研究团队猜想SARS患者的不良预后主要与免疫反应相关。（注：根据最早在柳叶刀发表的41例新冠肺炎患者的临床特征的报道中，患者多于起病第9日发展为ARDS，并出现高细胞因子血症，可能存在类似的病理生理改变。点击可查看相关文献）
为证实这一猜想，该研究团队利用疫苗和抗S蛋白IgG的主被动免疫策略在中华恒河猴体内评估抗S蛋白抗体在SARS-CoV诱导的急性肺损伤中的作用。
注意，下文中，如无相关背景建议直接跳过图片仅阅读正文和相关结论。
对该实验的介绍
研究团队首先用用编码全长SARS-CoVS蛋白的改良牛痘安卡拉（MVA）疫苗（ADS-MVA）接种干预组，对照组应用伪疫苗（ADC-MVA）（不编码S蛋白的改良牛痘安卡拉疫苗），在接种后第7天和第35天使用SARS冠状病*PUMC株对其进行感染。
结果显示，干预组均出现了高水平的SARS病*中和抗体，而对照组没有。使用SARS病*感染两组并确定两组均被感染后，发现干预组测出了较高水平的SARS病*核酸。这表明疫苗降低了SARS的增殖性感染。
但是，组织学检查显示，在接种后7天和35天时，在干预组的6只ADS-MVA接种的恒河猴中均出现了不同程度的急性弥漫性肺泡损伤，而ADC-MVA组中的大多数对照恒河猴仅表现出轻度到中度的炎症。进行肺组织病理学评分对比后显示，与对照组相比，ADS-MVA疫苗接种组在接种后7天和接种后35天时肺损伤显著增强。
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第一步的实验表明，抗S蛋白抗体在增强SARS-CoV介导的肺损伤中具有作用。
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研究团队进行了下一步实验，他们向对照组未被免疫的恒河猴中分别注射了低剂量（5mg）和高剂量（mg）的纯化抗S蛋白IgG。还有两只恒河猴被注射对照的无中和活性的IgG（C-IgG）。
核酸检测表明，高剂量纯化抗S蛋白IgG可以有效减少病*复制。但是所有接受抗S蛋白IgG的动物在第2天和第21天都出现了严重弥漫性肺泡损伤（DAD）的表现：肺组织内不同程度的渗出、透明膜形成、肺泡内出血和炎症。而对照组仅表现出轻度炎症。并且该团队还发现，虽然感染慢性期（后期）都出现了高水平的中和抗体，但是对照组只有少数出现弥漫性肺泡损伤。
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因此，该研究团队得出第二个结论：在感染急性期，抗S蛋白IgG虽然会减少病*复制，但是会导致严重的肺损伤。
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研究团队进一步研究抗S蛋白IgG在感染急性期加重肺损伤的原因。他们检测了肺组织中的单核细胞/巨噬细胞浸润和感染后2天的血清细胞因子谱。他们对SARS-CoV核衣壳蛋白（TRITC）和巨噬细胞标记物进行了双重免疫染色，包括MAC（FITC），CD（FITC）和CD68（FITC）。
结果显示：与对照组的肺部相比，抗S-IgG组的肺部炎性单核细胞和巨噬细胞明显增加，抗S蛋白IgG注射组动物的肺部组织能检测到更强的MAC和CD信号（图3C和补充图3）,这表明抗S蛋白IgG增强了炎性单核-巨噬细胞的浸润。此外更集中的CD68+信号进一步表明通过S-IgG治疗能改变巨噬细胞的基本应答。
此外高剂量抗S-IgG治疗的恒河猴体内观察到IL-8血清水平的提高，且IL-8水平和抗SARS-CoV中和抗体滴度有密切联系。而IL-8是引发急性肺损伤和ARDS的一个重要细胞因子。同时，他们还发现S-IgG并没有阻止SARS-CoV的侵入。
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因此，该研究团队得出第三个结论：抗S-IgG不能预防SARS-CoV的下呼吸道感染，甚至还会加重炎症单核-巨噬细胞在肺里的渗出和堆积，导致了过度的炎症反应。
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为了弄清楚抗S-IgG导致过度炎症反应的原因，该研究团队进一步分析在普通感染中，单核-巨噬细胞的作用。
他们在病情稳定状态下的中华恒河猴肺中发现了2个常驻巨噬细胞的亚群。分别是间质巨噬细胞（IMs、MAC+HAM56-CD-）（图4A）和表达低水平CD和CD的常驻肺泡巨噬细胞（AMs、CD68+HAM56-），而CD是巨噬细胞损伤修复反应的特殊标志物。
在用C-IgG（对照非中和抗体）处理并接种SARS-CoV的中华恒河猴的肺损伤中，炎性单核-巨噬细胞更明显的分为了两个亚群。一个亚群是新招募的MAC+HAM56-CD68-单核细胞，它类似于IM但是体积更大且与CD共表达。并且巨噬细胞中均检测到TGF-β表达水平升高（图4G–I），表明大量炎性单核-巨噬细胞和活化常驻肺泡巨噬细胞在感染后2天已开始承担了损伤愈合的功能。
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因此该研究团队得出第四个结论：肺泡单核细胞-巨噬细胞在早期未应用S-IgG治疗的恒河猴体内有损伤修复的功能。
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他们用相同的方法比较了经抗S-IgG注射的恒河猴，他们发现多数CD+HAM56–IMM共表达CD68（原本不表达CD68），提示抗S-IgG改变了该亚群的功能。而且，肺中固有巨噬细胞（CD+HAM56–）的抗S-IgG受体不再表达CD，其被许多CD+IMMs（图4F）包围，提示损伤修复功能及募集单核细胞的作用丧失。同时还出现了TGF-β减少和IL-6高表达。
因此该团队得出第五个结论：肺泡巨噬细胞（AMs）在急性肺部感染中发生表型和功能改变，大量单核-巨噬细胞在消除炎症中承担了损伤修复功能，但抗S-IgG的出现使损伤修复反应减弱，导致不受控制的炎症和组织损伤发生。
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该团队进一步研究为何S-IgG的作用具有时限性，从而仅在感染早期造成影响。
他们发现血清有中和抗体反应和持续病*感染的中华恒河猴中出现了显著的炎性巨噬细胞反应增强和修复性巨噬细胞减少。而出现持续病*感染但未检测到中和抗体反应的中华恒河猴或有中和抗体但无持续病*感染的中华恒河猴没有出现类似反应。
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因此研究团队得出推论：在病*清除之前出现的抗体反应抑制了损伤修复反应并导致炎性细胞浸润增加。
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为了研究为何出现了损伤修复反应的减弱，研究团队进行了进一步实验。他们的实验在体外进行，使用体外旁路活化的巨噬细胞，用SARS伪病*进行处理后，加入抗S-IgG、对照IgG以及健康恒河猴的血清。他们发现经典活化的巨噬细胞（M1巨噬细胞）的细胞因子分泌增加并不多，而旁路活化的巨噬细胞（M2巨噬细胞，起损伤修复作用）的细胞因子分泌增加较多。并且抗S-IgG作用后会使其出现剂量依赖性的细胞因子分泌和活化增加，而对照组没有出现类似反应。并且还发现在存在Fcγ受体（FcγR）阻断抗体的情况下，这一现象没有出现。说明抗SARS-CoV抗体可通过FcγR部分改变损伤修复反应。
因此该团队得出结论：抗S-IgG在急性感染过程中直接改变了旁路活化的巨噬细胞（M2巨噬细胞）的功能反应，从而使损伤修复反应失调，导致细胞因子风暴，侵袭性炎症和严重的肺损伤。
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上面的研究为基础的动物实验研究，为了研究临床患者是否存在类似的变化，该团队调查了死亡SARS患者和康复患者在感染初期的抗体反应，并分析了3例死亡SARS患者肺中单核-巨噬细胞的异质性。
他们发现，与动物实验类似，死亡SARS患者血清中表现有更高水平的中和抗体，肺组织中出现更严重的炎性反应、巨噬细胞浸润以及缺少修复性巨噬细胞。
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他们进一步使用死亡患者的血清进行了前述的体外实验，发现了类似结果，在SARS伪病*处理的体外旁路活化的巨噬细胞中加入死亡患者血清，细胞因子的分泌出现了剂量依赖性的增加。并且这一过程可以被FcγR阻断抗体所阻断，与此前动物实验一致。并且死亡患者血清的IL-8的产生与中和抗体滴度有密切相关。
因此该研究作者得出结论：死亡SARS患者的血清在SARS-CoV感染过程中通过FcγR部分性改变了损伤修复反应从而诱发了过度的免疫反应。
总结
这一研究从基础到临床，一步步证实了，在SARS感染中，在感染期出现的高滴度抗病*中和抗体会加重患者过度的免疫反应引发严重的肺损伤，并明确了其可能机制。
而目前新冠肺炎中，通过初步的病理学和临床证据，COVID-19可能存在类似的病理和病理生理学改变。此前的对41例患者的临床特征研究表明患者血中出现高水平的细胞因子（点击查看），病理学表明死亡患者出现高度促炎性的淋巴细胞增加（点击查看），但是目前尚未有研究报告患者的血清学检测，我们期待对患者病程中的血清学抗体滴度的研究可以揭示免疫反应与COVID-19病重乃至死亡的相关性。
但该研究也向我们警示，在重症患者中应用康复期血浆有可能由于高水平的中和抗体滴度的存在而引发严重的炎症反应和肺损伤。在该研究中已经揭示，病*未清除时中和抗体的存在会引起炎症肺损伤和免疫反应。这一研究的结果为血浆治疗、免疫球蛋白治疗乃至单克隆抗体治疗敲响了警钟。此类通过主动或被动特异性免疫的治疗很有可能有很高的风险。
单克隆抗体本身便是高度纯化的中和抗体，而康复期血浆也同样含有高滴度的中和抗体（在SARS的研究中，恢复患者在起病20日抗体水平到达峰值）。我们推测COVID-19患者与之类似。应用此类疗法进行治疗要如何才能避免此类反应的发生？这是值得探讨和论证的问题。
因此，在此前多项研究的基础上，血浆治疗是否应当被推广应用甚至被鼓吹为重症患者的希望，这是值得深思的。
我们希望有进一步临床研究证实其有效性与安全性，并且反对未经证实的有较高风险但获益存疑的疗法被推广大规模应用。
我们声明没有利益相关。
参考文献
[1]LiuL,WeiQ,LinQ,etal.Anti-spikeIgGcausessevereacutelunginjurybyskewingmacrophageresponsesduringacuteSARS-CoVinfection[J].JCIInsight,,4(4).
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